ปลากระเบนนั้นจะเริ่มทำการผสมพันธุ์ได้ก็ต่อเมื่อมีอายุได้ 2-3 ปี ซึ่งเมื่ออายุตรงตามเกณฑ์นี้ก็จะทำการคัดมาเป็นพ่อแม่พันธุ์ได้แล้ว สำหรับการดูเพศของปลากระเบนนั้นเราสามารถดูได้จากอวัยวะเพศ ซึ่งในเพศผู้นั้น จะมีอวัยเพศใต้หาง 2 อัน ส่วนในปลากระเบนเพศเมียจะมีมดลูก 1 ช่อง แต่ภายในมดลูกนั้นจะแบ่งออกเป็น 2 ช่อง การผสมพันธุ์ควรปล่อยให้พ่อแม่พันธุ์อยู่ด้วยกัน ซึ่งเพศผู้จะมีพฤติกรรมกัดขอบจานของเพศเมีย เพื่อทำการยกเพศเมียให้ลอยขึ้นจากนั้นเพศผู้จะทำการพลิกตัวเองหงายมาผสม ซึ่งการผสมพันธุ์นั้นจะใช้เพศผู้ 1 ตัว ต่อเพศเมีย 2 ตัว เพื่ออัตราการตั้งท้องของเพศเมียที่สูงขึ้น ซึ่งตามจริงแล้วเพศผู้สามารถผสมเพศเมียได้มากถึง 10 ตัวเลยทีเดียว
สำหรับปลากระเบนนั้นจะใช้ระยะเวลาในการตั้งท้องประมาณ 3-4 เดือน ซึ่งในแต่ละท้องจะมีปลากระเบนประมาณ 1-20 ตัว ข้อนี้ก็ขึ้นอยู่กับแต่ละสายพันธุ์ด้วย หลังจากที่ปลากระเบนตั้่งท้องแล้ว ต้องทำการสังเกตด้วยว่า เมื่อใดก็ตามที่แม่พันธุ์คลอดลูกปลากระเบนออกมาแล้ว ให้ทำการแยกลูกออกทันที เพื่อป้องกันปลากระเบนเพศผู้กัดกินลูกปลา และต้องทำการแยกแม่พันธุ์ออกจากแม่พันธุ์ด้วย ปลากระเบนเพศเมียจะมีกลิ่นฮอร์โมนที่ล่อเพศผู้ให้มาผสมพันธุ์ ครั้งที่1 เมื่อถึงวัยเจริญพันธุ์ ครั้งที่2 หากไม่แยกแม่พันธุ์ออกมาต่างหากเพศผู้อาจจะเข้ามาผสมทำให้ได้ลูกที่ไม่สมบูรณ์ ดังนั้นจึงต้องแยกเพศเมียออกมาอย่างน้อย 5-7 วันหากต้องการลูกปลากระเบน จึงจับเข้าคู่ผสมใหม่ได้